2

In  the  current  work,  to  investigate  amino  acid  substitutions that  might  enhance  the  catalytic  efficiency  of  SMO,  a  rationaldesign  approach  was  undertaken,  which  relied  on  molecular  docking  assisted  by  the  AutoDock  program  and  focused  on  those  aminoacid  residues  that  might  interact  with  the  phenyl  ring  of  styrene.The  SMO  from  Pseudomonas  sp.  LQ26  (designated  as  StyAB2)  wasused  as  the  parental  enzyme  since  it  has  been  well  studied  in  ourlaboratory  as  a  highly  selective  biocatalyst  (Lin  et  al.,  2010,  2011b,c;Qaed  et  al.,  2011),  and  its  high  homology  with  other  SMOs  from  thegenus  of  Pseudomonas  would  facilitate  the  docking  study.  This  strategy  led  to  several  SMO  mutants  with  increased  enzymatic  activitiestoward  styrene,  and  one  mutant  displayed  reversed  enantioselectivity  toward  the  substrate  1-phenylcyclohexene.

2.  Materials  and  methods

2.1.  Chemicals

The  substrates  styrene,  trans- -methyl  styrene,  2-vinylpyridineand  1-phenylcyclohexene  were  purchased  from  Alfa  Aesar  (Tianjin,  China).  Racemic  styrene  oxide  (1S,  2S)-1-phenylpropyleneoxide  and  (1R,  2R)-1-phenylpropylene  oxide  were  purchased  fromSigma–Aldrich  (St.  Louis,  MO,  USA),  and  used  as  standard  products.Other  standard  products  including  racemic  1-phenylcyclohexeneoxide  and  2-(oxiran-2-yl)pyridine  were  synthesized  from  the  corresponding  alkenes  according  to  the  literatures  (Fieser  and  Fieser,1967;  Hanzlik  et  al.,  1976).  Other  reagents  were  purchased  from general  suppliers  and  were  used  without  further  purification

2.2.  Docking  studies

The  X-ray  crystal  structure  of  the  oxygenase  subunit  of  SMO(SMOA)  from  P.  putida  S12  was  available  from  the  PDB  database (PDB  ID:  3IHM).  The  amino  acid  sequence  of  this  subunit  shares

 

an  89%  identity  with  the  same  subunit  of  the  SMO  from  Pseudomonas  sp.  LQ26.  To  prepare  the  structure  for  docking,  chain  Bof  the  StyA  homodimer  and  all  water  molecules  of  SMOA  were removed,  and  charges  and  non-polar  hydrogen  atoms  were  added using  MGLTools  1.5.4.  AutoDock  4.0  was  used  for  docking,  and  the docking  parameters  were  kept  to  their  default  values  in  general (Morris  et  al.,  1998)  except  that  the  grid  spacing  was  changed  to 0.275,  the  number  of  AutoDock  4  GA  runs  was  increased  from  10  to 50,  and  the  docking  grids  were  set  as  22  ×  32  ×  22˚ A  for  styrene  and 28  ×  32  ×  28˚ A  for  1-phenylcyclohexene.  The  50  independent  runs from  AD4  were  analyzed  in  MGLTools  1.5.4  and  the  results  were visualized  using  the  program  Pymol

2.3.  Construction  of  point  mutations

Site-directed  mutagenesis  was  performed  according  to  the QuikChange® site-directed  mutagenesis  protocol  (Stratagene,  La Jolla,  CA)  using  the  plasmid  pETAB  (Lin  et  al.,  2010)  encoding  the wild-type  StyAB2  (GenBank  ID:  GU593979)  as  the  template.  The sequences  of  mutagenic  oligonucleotide  primers  (Table  1)  were synthesized  by  Shanghai  Invitrogen  Life  Technologies.  The  PCR product  was  treated  with  20  U  of  Dpn  I  at  37 ◦ C  for  2  h  and  transformed  into  DH5˛  competent  cells.  The  successful  introduction  of the  desired  mutations  was  confirmed  by  sequencing  at  Shanghai Invitrogen  Life  Technologies.

2.4.  Expression  of  the  wild-type  and  mutant  StyAB2  in  E.  coli  BL21

E.  coli  strain  BL21(DE3)  containing  the  constructed  plasmids was  used  to  produce  the  wild-type  and  mutant  StyAB2.  Single colonies  were  picked  up  and  grown  overnight  at  37 ◦ C  in  LuriaBertani  broth  containing  50  g  kanamycin/ml.  For  each  mutant  and the  wild-type,  two  single  colonies  were  picked  and  cultivated  to make  two  independent  heterologous  expressions.  The  overnight culture  (2  ml)  was  inoculated  into  Terrific  Broth  (200  ml)  containing  50  g  kanamycin/ml  in  a  500  ml  flask  and  incubated  at  37 ◦ C  for 3  h  followed  by  18  h  incubation  at  20 ◦ C  with  gyratory  shaking  at 220  rpm.  The  cells  were  harvested  by  centrifugation,  washed  twice with  potassium  phosphate  buffer  (0.1  M,  pH  7)  and  stored  at  4◦C.

To  determine  the  expression  levels  of  the  wild-type  and  mutant enzymes,  crude  cell  extracts  were  analyzed  by  SDS-PAGE,  then  the oxygenase  subunit  was  purified  using  Profinity  IMAC  Ni-Charged resin  (Bio-Rad,  Hercules,  CA,  USA)  as  described  previously  (Lin  et  al.,2010).  Then,  the  purified  proteins  were  analyzed  by  SDS-PAGE.  The protein  content  was  determined  with  a  commercial  BCA  Protein Assay  kit  using  bovine  serum  albumin  as  a  standard  (Beyotime, Beijing,  China)

2.5.  Biotransformation  with  whole  cells  and  product  analysis

The  harvested  recombinant  E.  coli  BL21  cells  expressing  the wild-type  and  mutants  with  a  cell  dry  weight  (CDW)  of  0.1  g were  resuspended  in  a  biphasic  system  (Lin  et  al.,  2010;  Panke et  al.,  1999)  of  10  ml  potassium  phosphate  buffer  (100  mM,  pH 6.5)  containing  10%  (v/v)  bis-(2-ethylhexyl)  phthalate  (BEHP)  with the  addition  of  10  mg  styrene  or  1-phenylcyclohexene.  For  2-vinyl pyridine,  a  monophasic  system  without  BEHP  resulted  in  better conversion  and  thus  was  applied  instead  of  the  biphasic  system.  The reaction  was  carried  out  at  30 ◦ C  for  4  h  with  shaking  at  230  rpm  and terminated  by  extraction  with  ether.  The  organic  phases  were  combined,  dried  with  anhydrous  sodium  sulfate,  concentrated  under vacuum,  and  subjected  to  GC  and  chiral  HPLC  analysis. Specific  epoxidation  activities  were  measured  using  whole  cells following  the  literatures  (Bae  et  al.,  2008;  Park  et  al.,  2006).  Briefly, recombinant  E.  coli  BL21  cells  with  0.5  g  CDW/L  were  resuspended in  4  ml  potassium  phosphate  buffer  (100  mM,  pH  7.0)  containing glucose  (5  g/L),  and  incubated  at  30 ◦ C  for  10  min  before  the  addition of  1.5  mM  substrate  (30  mM  stock  solution  of  styrene  or  trans- -methyl  styrene  in  ethanol).  The  reaction  was  continued  for  5  min. The  mixture  was  extracted  with  ether  containing  0.1  mM  dodecane as  an  internal  standard  and  analyzed  with  gas  chromatography (GC).  One  unit  (U)  is  defined  as  the  activity  that  produces  1  mol of  oxide  per  min.

GC  analysis  was  performed  on  a  Fuli  9790  II  system connected  to  a  flame  ionization  detector  using  column  BP5 (30  m  ×  0.22  mm  ID  ×  0.25  m  film  thickness,  SGE  Analytical Science,  Australia)  to  determine  the  conversion  of  each  substrate  (styrene,  trans- -methyl  styrene,  2-vinylpyridine  or  1-phenylcyclohexene)  to  the  corresponding  epoxide.  Enantiomeric excesses  were  determined  using  chiral  HPLC  on  a  Shimadzu  LC 20-AD  (Shimadzu,  Japan)  with  a  PDA  detector  using  Daicel  Chiralpak  AS-H  column  for  styrene  oxide  (hexane:2-propanol  =  90:10, 0.5  ml/min,  tR(R)  10.27  min,  tR(S)  10.67  min),  Chiralcel  AD-H  column  for  2-methyl-3-phenyloxirane  (hexane:2-propanol  =  90:10, 1  ml/min,  tR(R)  4.14  min,  tR(S)  4.78  min),  or  Chiralcel  OD-H  column  for  1-phenylcyclohexene  oxide  (hexane:2-propane  =  99:1, 0.5  ml/min,  tR(R,R)  12.53  min,  tR(S,S)  13.67  min)  and  2-(oxiran-2-yl)pyridine  (hexane:2-propane  =  95:5,  0.5  ml/min,  tR(R)  15.05  min, tR(S)  15.83  min)

3.  Results

The  SMOA  structure  from  P.  putida  S12  has  been  released  without  substrate  and  FMN.  Based  on  the  putative  substrate-binding center  of  SMOA  as  well  as  our  previous  work,  which  has  shown  the residues  43–46  being  close  to  the  -substitute  of  ˛-ethylstyrene, the  native  substrate  styrene  was  docked  into  SMOA  using  AutoDock 4.0.  The  returned  50  results  were  analyzed  in  the  MGL  tools  1.5.4, and  the  highest  scoring  conformer  with  the  vinyl  group  of  styrene adjacent  to  the  residues  43–46  was  shown  in  Fig.  2

 

The  amino  acid  residues  Tyr73,  His76  and  Ser96,  which  form  the bottom  of  the  substrate-binding  pocket,  were  found  to  be  adjacent to  the  benzene  ring  of  styrene  with  their  side  chains  facing  the substrate  with  distances  of  7.15,  11.93  and  9.48˚ A,  respectively (Fig.  2).  It  is  well  recognized  that  residues  adjacent  to  the  substrate play  a  critical  role  in  catalytic  activity,  and  thus  commonly  act  as the  target  sites  for  rational  design.  In  addition,  unlike  the  residues 43–46,  residues  Tyr73,  His76  and  Ser96  are  away  from  the  putative FAD  binding  channel,  which  would  avoid  negative  impacts  on  catalytic  activity  caused  by  reduced  FAD  binding  (Feenstra  et  al.,  2006; Ukaegbu  et  al.,  2010).  Therefore,  residues  Tyr73,  His76  and  Ser96 were  modified  using  site-directed  mutagenesis  to  investigate  their effects  on  the  enzymatic  activity  and  enantioselectivity.  Three amino  acid  substitutions  were  designed  for  each  site  in  a  way  to reflect  typical  changes  in  size  and  hydrophobicity  of  the  side  chain of  the  residue.  Tyr73  was  replaced  with  Phe,  Val  and  Ser.  Compared with  Tyr,  Phe  lacks  the  hydroxyl  group  while  retaining  the  aromatic structure;  Ser  lacks  the  aromatic  structure  while  retaining  the hydroxyl  group;  and  Val  lacks  both  the  hydroxyl  group  and  the aromatic  structure,  but  retains  part  of  the  steric  hindrance.  His76 was  replaced  with  Asn,  Val  and  Ala,  all  of  which  lack  the  electronically  charged  side  chain,  but  contain  a  polar  but  uncharged  residue (for  Asn),  or  representative  hydrophobic  residues  (for  Val  and  Ala). Ser96  was  replaced  with  Ala,  Leu  and  Thr.  Compared  with  Ser, Thr  retains  the  hydroxyl  group  with  an  additional  methyl  group; and  Leu  and  Ala  lack  the  hydroxyl  group  and  are  representative hydrophobic  residues  with  varied  side  chain  sizes 

All  the  constructed  mutants  listed  in  Fig.  3  were  functionally  expressed  in  E.  coli  at  a  level  similar  to  the  wild-type.  Their activities  were  examined  in  the  epoxidation  of  styrene  in  the  biphasic  reaction  for  4  h  (Lin  et  al.,  2010;  Panke  et  al.,  1999).  All  active mutants  retained  excellent  enantioselectivity,  yielding  the  product  (S)-styrene  oxide  with  >99%  ee.  Mutants  Y73F,  Y73V  and  S96A exhibited  higher  activities  than  the  wild-type,  while  other  mutants showed  lower  activities  or  even  major  deleterious  effect  (Fig.  3). The  best  mutant  S96A  displayed  a  relative  activity  of  180%  (Fig.  3)

 

 Specific  epoxidation  activities  were  then  measured  for  the  most active  mutants  when  the  assays  were  carried  out  in  an  aqueous system  for  5  min  (Panke  et  al.,  1998;  Park  et  al.,  2006).  The  results confirmed  the  increased  enzymatic  activity  of  mutants  Y73F,  Y73V and  S96A  for  the  epoxidation  of  styrene,  as  well  as  for  trans- -methyl  styrene  (Fig.  4)  without  any  negative  impact  on  their enantioselectivities.  The  whole  cell  specific  epoxidation  activity  of the  wild-type  StyAB2  was  66.5  U/g  CDW,  which  was  comparable  to that  of  the  other  SMOs  measured  under  similar  conditions,  such  as that  from  Pseudomonas  sp.  VLB120  (79  ±  5  U/g  CDW)  and  P.  putida SN1  (55  ±  5  U/g  CDW)  (Panke  et  al.,  1998;  Park  et  al.,  2006).  The  specific  epoxidation  activities  of  the  most  active  mutant  S96A  toward styrene  and  trans- -methyl  styrene  were  2.6  and  2.3-fold  of  the wild-type,  respectively  (Fig.  4).

For  substrates  2-vinyl  pyridine  and  1-phenylcyclohexene,  the changes  in  activities  were  varied  for  the  mutants  Y73F,  Y73V and  S96A.  Only  S96A  and  Y73V  displayed  slight  increases  in  the 2-vinyl  pyridine  and  1-phenylcyclohexene  conversions,  respectively  (Table  2).  Interestingly,  the  asymmetric  epoxidation  of 1-phenylcyclohexene  catalyzed  with  the  Y73V  mutant  displayed
reversed  enantioselectivity  compared  to  the  wild-type,  resulting  in the  (R,R)-enantiomer  with  60%  enantiomeric  excess  (Table  2),  while the  epoxidation  of  styrene,  2-vinylprydine  and  trans- -methyl styrene  catalyzed  with  the  same  mutant  yielded  (S)-enantiomers with  >99%  ee,  the  same  as  the  wild-type.

 

4.  Discussion

Crystal  structure-based  rational  design  of  proteins  focuses  on  a small  number  of  variants  and  directly  tests  the  substrates  of  interest to  avoid  the  screening  of  a  huge  number  of  mutants  using  substrate analogues.  This  method  has  proven  to  be  efficient  for  the  improvement  of  a  variety  of  enzymatic  properties  (Bornscheuer  and  Pohl, 2001;  Schmidt  et  al.,  2009;  Voigt  et  al.,  2001).

In  this  work,  three  potentially  critical  residues  in  the  SMO  from Pseudomonas  sp.  LQ26  were  proposed  according  to  structure-based molecular  modeling,  and  three  mutants,  Y73F,  Y73V  and  S96A,  were identified  to  exhibit  higher  activity  in  styrene  epoxidation  compared  to  the  wild-type  enzyme.  Amino  acid  residues  at  positions  73 and  96  are  the  same  for  all  SMOs  originating  from  the  genus  Pseudomonas,  as  well  as  the  one  from  the  metagenome  (van  Hellemond et  al.,  2007),  i.e.  Tyr  and  Ser,  respectively.  However,  it  is  noteworthy  that  self-sufficient  one-component  SMOs  have  Ile  and  Ala  at  the corresponding  positions,  respectively,  which  includes  the  StyA2B from  Rhodococcus  opacus  1CP  (Tischler  et  al.,  2009)  and  two  putative SMOs  from  Nocardia  farcinica  IFM10152  and  Arthrobacter  aurescens
TC1  (Fig.  5).  Furthermore,  for  several  putative  SMOs,  both  the  amino acid  substitutions  Y73V  and  S96A  exist  naturally  (Fig.  5),  indicating  that  these  substitutions  have  already  been  explored  by  natural evolution,  although  whether  they  would  indicate  higher  activity in  native  proteins  is  correctly  unknown.  Experimental  studies  on those  putative  enzymes  might  provide  more  information  on  the structure–functional  relationship  of  SMOs  in  the  future

 

Hydrophobic  interaction  appeared  to  be  critical  at  position  73. Replacement  of  the  Tyr  residue  with  Phe  or  Val  increased  the  activity,  while  loss  of  the  hydrophobic  side  chain  led  to  significantly impaired  activity  for  the  Y73S  mutant.  In  fact,  the  putative  substrate  binding  site  of  SMO  is  completely  buried  within  the  protein core,  surrounded  by  more  than  ten  hydrophobic  residues  and  only four  hydrophilic  residues.  The  high  hydrophobicity  is  regarded as  being  consistent  with  the  hydrophobic  nature  of  the  substrate styrene  (Ukaegbu  et  al.,  2010).  On  the  other  hand,  the  size  of  the side  chain  of  the  residue  at  position  96  dramatically  affects  the  enzymatic  activity  of  SMO.  The  mutant  S96T  only  added  an  additional  methyl  group  on  the  side  chain  compared  with  the  wild-type, but  lost  most  of  the  enzymatic  activity  (Fig.  3).  The  substitution  of Ser  with  Ala  was  well  accepted  and  resulted  in  increased  activity, while  larger  residue  such  as  Leu  led  to  a  complete  loss  of  activity  (Fig.  3).  Surprisingly,  when  the  mutants  S96T,  S96A  and  S96L were  modeled  using  the  SWISS-MODEL  version  8.05  (Kiefer  et  al., 2009)  and  applied  in  the  automatic  docking  of  styrene,  no  difference  was  found  in  terms  of  the  binding  energy,  intermolecular energy,  internal  energy  or  torsional  energy  for  all  three  resulting docking  complexes  compared  with  the  wild-type.  Based  on  the mechanism  of  this  biocatalytic  epoxidation  reaction,  the  reactive cavity  should  accommodate  not  only  styrene,  but  also  the  reduced FAD  and  oxygen,  and  the  binding  of  substrate  is  indeed  affected by  the  presence  of  FAD  (Ukaegbu  et  al.,  2010).  The  docking  model where  only  styrene  occupies  the  cavity  could  only  provide  limited information  and  may  not  reflect  subtle  changes  in  protein  structure.  It  could  be  hypothesized  that  the  replacement  of  Ser  with larger  residues  such  as  Leu  might  affect  FAD  binding  indirectly  or weaken  the  interaction  of  reduced  FAD  with  the  substrate  through the  subtle  movement  of  the  substrate  in  the  active  pocket  pushed by  the  steric  hindrance  of  the  side  chain.  In  addition,  residues  Tyr73 and  Ser96  are  located  at  the  same  domain  of  the  oxygenase  subunit  of  the  SMO  on  the  3-  and  4-sheet,  respectively,  and  are  very close  to  each  other  with  a  distance  of  3.41˚ A.  Therefore,  the  amino acid  substitution  with  large  side  chain  at  position  73  might  cause distortion  of  the  local  structure  within  the  limited  space,  and  thus result  in  major  deleterious  effects  on  the  catalytic  reaction.  On  the contrary,  smaller  side  chains  at  either  position  73  or  96  may  benefit  the  intermolecular  interaction  causing  higher  activity  in  the mutants  Y73V  and  S96A.  However,  the  double  mutant  combining the  beneficial  substitutions  of  Y73V  and  S96A  did  not  show  cumulative  effect,  and  its  enzymatic  activity  toward  styrene  remained similar  to  that  of  the  mutant  S96A  (data  not  shown).  The  result indicates  that  the  S96A  mutation  might  have  created  enough  space for  the  proper  orientation  of  the  -sheets.  Therefore,  further  reduction  of  the  size  of  the  side  chain  at  position  73  would  have  little beneficial  effect.

In  the  majority  of  cases  in  this  study,  the  mutations  did  not affect  the  enantioselectivity  of  the  enzyme.  Therefore,  we  assumed that  the  putative  active  cavity  of  SMO  should  be  strictly  shaped  by surrounding  residues  and  the  mutations  could  hardly  change  the orientation  of  the  substrate.  The  reversal  of  enantioselectivity  for the  mutant  Y73V  during  the  epoxidation  of  1-phenylcyclohexene was  unexpected  because  all  other  experimentally  assigned  SMOs display  the  same  enantioselectivity  (Bernasconi  et  al.,  2000;  Di Gennaro  et  al.,  1999;  Lin  et  al.,  2010;  Panke  et  al.,  1998;  Park  et  al., 2005;  Tischler  et  al.,  2009;  van  Hellemond  et  al.,  2005),  and  the overall  structure  of  the  active  cavity  of  SMOs  should  not  be  flexible  enough  to  generate  complementary  enantiomers.  Moreover, the  mutants  from  directed  evolution  were  also  reported  to  produce (S)-enantiomers  (Gursky  et  al.,  2010).

Based  on  the  fact  that  no  reversal  of  stereoselectivity  was observed  for  the  Y73V  mutant  with  the  substrates  styrene,  2-vinylprydine  or  trans- -methyl  styrene,  we  hypothesized  that  this
reversal  of  stereoselectivity  might  be  due  to  the  structural  flexibility  of  this  particular  substrate,  1-phenylcyclohexene,  which contains  a  cyclohexenyl  group  that  adopts  a  half-chair  conformation  with  C2symmetry.  The  representative  binding  modes  for 1-phenylcyclohexene  into  the  putative  active  site  of  SMO  resulting  from  automated  docking  are  shown  (Fig.  6A  and  B).  Unlike styrene  or  styrene  derivatives  which  displayed  distinct  preference  to  one  single  orientation  in  automated  docking,  and  often produced  enantiopure  oxide  with  >99%  ee  (Lin  et  al.,  2011b),  the symmetric  cyclohexenyl  group  in  1-phenylcyclohexene  apparently resulted  in  much  reduced  stereoselectivity  as  the  two  highest  scoring  conformers  in  Fig.  6  were  estimated  by  the  program  with  very similar  energy  and  docking  scores.  Since  the  putative  substrate binding  cavity  is  located  at  the  bottom  of  the  FAD  binding  site (Ukaegbu  et  al.,  2010),  oxygen  and  reduced  FAD  would  come  from the  same  direction  for  both  conformers  (Fig.  6A  and  B).  Therefore,  the  (S,S)  and  (R,R)-enantiomers  of  the  oxide  product  would be  achieved  from  the  two  conformers  shown  in  Fig.  6A  and  B, respectively.

The  biotransformation  results  indicated  that  the  conformer  in Fig.  6A  should  be  slightly  preferred  by  the  wild-type  enzyme, leading  to  the  formation  of  (1S,  2S)-1-phenylcyclohexene  oxide with  medium  enantioselectivity  (71%ee).  The  replacement  of  tyrosine  with  valine  may  have  weakened  the  strong  –   interactions between  the  substrate  and  enzyme  by  the  loss  of  the  phenyl  group from  the  side  chain  at  position  73  and  increased  the  flexibility  of  the active  pocket.  In  addition,  the  size  of  the  pocket  may  have  expanded due  to  the  reduced  volume  of  the  side  chain,  which  may  also  facilitate  the  reversal  of  enantiomeric  preference.  However,  the  active site  of  the  Y73V  mutant  should  not  have  changed  significantly  as its  selectivity  toward  styrene,  2-vinylprydine  and  trans- -methyl styrene  remained  the  same  as  the  wild-type.  Therefore,  the  stereoswitch  of  the  Y73V  mutant  toward  1-phenylcyclohexene  was apparently  triggered  by  subtle  changes  in  the  protein  structure, which  only  took  effect  for  this  particular  substrate  with  a  symmetric  cyclohexenyl  group  and  having  two  conformers  with  similar energy  in  the  automatic  docking  study.

In  conclusion,  three  amino  acid  substitutions,  Y73F,  Y73V,  and S96A  were  identified  via  a  rational  design  approach  to  enhance the  catalytic  efficiency  of  SMO.  These  residues  are  located  in  the putative  active  pocket  of  the  enzyme  and  could  possibly  interact  with  the  phenyl  ring  of  the  native  substrate,  styrene.  One of  the  mutants,  Y73V,  displayed  reversed  enantiomeric  preference  toward  the  substrate  1-phenylcyclohexene  while  retaining the  same  enantioselectivity  toward  other  substrates.  The  results extended  the  knowledge  of  the  structural–sequence  relationship  of SMOs  and  demonstrated  that  structure-based  rational  design  was an  efficient  approach  to  altering  the  characteristics  of  this  enzyme.